Elizabeth ve Roy Henry Jackson çiftinin tek çocuğu olarak Washington D.C.'de doğdu. Chattanooga, Tennessee'de annesi tarafından büyütüldü. Babasını ömrü boyunca sadece 2 kez gören sanatçının, kendine ve çocuğuna bakabilmek için fabrika işçiliği gibi birçok farklı işte çalıştı. Riverside Lisesi'nde okudu. Morehouse College'da Sualtı Biyolojisi okurken oyunculukla tanıştı ve bölümünü değiştirerek 1972'de mezun oldu. Tiyatro kökenli Samuel L. Jackson, 1980'lerle birlikte sinema filmlerinde küçük roller almaya başladı. Die Hard serisinin üçüncüsünde Bruce Willis'le ve The Long Kiss Godnight'da Geena Davis'le beraber rol alarak bugünkü popülerliğini kazandı. Yani 40'ından sonra şöhrete kavuştu. Ona sinemada ilk şans tanıyan isim kendisi gibi bir siyah olan yetenekli yönetmen Spike Lee'dir. Onun Do The Right Thing ve Jungle Fever gibi birkaç filminde yardımcı rollerde çok iyi performanslar ortaya koyan Jackson, daha sonra Tarantino'nun Pulp Fiction'ında İncil'den ezbere bölümler okuyan gangster Jules karakteriyle dikkatleri üzerine çekti ve Hollywood'un pek çok büyük prodüksiyonunda rol alma şansına kavuştu. Yine Tarantino'nun Jackie Brown'ındaki silah ve uyuşturucu kaçakçısı Ordell rolüyle Berlin Film Festivali'nden bir Altın Ayı kazandı. Amerika Film Endüstrisi'ndeki önyargılar ve siyah oyunculara yeteneklerini ortaya koyabilecekleri rollerin teklif edilmemesi nedeniyle geç üne kavuşan Jackson, son yıllarda bunun acısını çıkartırcasına yılda 3-4 filmde oynamaktadır. Star Wars'un 2000'lerdeki 2. üçlemesinde Mace Windu karakterini canlandırdı. Marvel Sinema Evreni'ne Nick Fury karakteriyle girdi. 2012 yapımı Tarantino filmi Django Unchained'de Stephen karakteriyle bir kez daha yeteneğini ispatladı. Bir sonraki Tarantino filmi The Hateful Eight'te de başroldeydi.

1980'de LaTanya Richardson ile evlenen Jackson'ın 1982 doğumlu Zoe adında bir kızı vardır.